L Latar belakang: kanker rongga mulut, khususnya oral squamous cell carcinoma (oscc), merupakan jenis kanker kepala dan leher yang paling sering ditemukan dan masih menjadi permasalahan kesehatan yang signifikan. sel hsc-3 merupakan sel lini yang bersifat agresif dan banyak digunakan sebagai model in vitro dalam penelitian antikanker. keterbatasan terapi konvensional mendorong pengembangan alternatif berbasis bahan alam. cnidoscolus aconitifolius diketahui mengandung berbagai senyawa bioaktif yang berpotensi menghambat pertumbuhan sel kanker. tujuan: untuk mengetahui efek ekstrak fraksi etanol, etil asetat, dan n-heksana daun c. aconitifolius terhadap sitotoksitas sel lini hsc-3. metode: penelitian ini merupakan penelitian eksperimental menggunakan uji cck-8. sel kanker rongga mulut hsc-3 diberi perlakuan fraksi etanol, etil asetat, dan n-heksana daun c. aconitifolius pada konsentrasi 200, 400, 800, 1.600, dan 3.200 µg/ml. kelompok perlakuan dibandingkan dengan kontrol negatif (dmem), kontrol pelarut (dmso), dan kontrol positif doksorubisin 3 µm. setelah inkubasi 24 jam, viabilitas sel diukur menggunakan microplate reader panjang gelombang 450 nm. data dianalisis menggunakan uji kruskal–wallis dan uji post hoc, dan ditentukan nilai ic₅₀ untuk menilai tingkat sitotoksisitas. hasil: hasil penelitian menunjukkan adanya perbedaan bermakna viabilitas sel antar kelompok perlakuan (p < 0,05). fraksi etil asetat menunjukkan penurunan viabilitas sel paling signifikan sebesar 36,6% pada konsentrasi 3.200 𝜇g/ml, memiliki nilai ic₅₀ paling rendah yaitu 2.945 𝜇g/ml dibandingkan fraksi etanol dan n-heksana, sehingga menunjukkan potensi sitotoksik paling kuat terhadap sel hsc-3. kesimpulan: fraksi etil asetat daun c. aconitifolius memiliki potensi sitotoksik paling kuat terhadap sel kanker rongga mulut hsc-3 dan berpotensi dikembangkan sebagai kandidat awal agen antikanker berbasis bahan alam.kata kunci : c. aconitifolius, hsc-3, sitotoksisitas, cck-8, fraksinasi