L Latar belakang: karsinoma sel skuamosa rongga mulut merupakan tipe kankeryang paling sering ditemukan dan memiliki angka mortalitas yang cukup tinggi.salah satu faktor penting dalam perkembangannya adalah infeksi humanpapillomavirus (hpv), terutama tipe risiko tinggi seperti hpv-16. deteksi dinihpv-16 menjadi hal yang penting, tetapi metode pcr sebagai standar emasmembutuhkan peralatan khusus dan waktu pemeriksaan yang relatif lama.recombinase polymerase amplification (rpa) merupakan metode amplifikasiisotermal yang lebih cepat dan sederhana, sehingga berpotensi mendukungpemeriksaan di fasilitas kesehatan dengan keterbatasan alat. tujuan: untukmengoptimasi teknik rpa dalam mendeteksi hpv-16 pada lini sel squamous cellcarcinoma (upci-scc-090), dengan parameter konsentrasi dna, suhu dan waktuinkubasi, serta ukuran amplikon. metode: penelitian observasional deskriptifdilakukan pada lini sel scc positif hpv-16. dna diekstraksi menggunakan zymodna miniprep plus kit dan diuji kemurniannya. tiga pasangan primer dari publikasisebelumnya divalidasi menggunakan pcr untuk menentukan primer palingspesifik yang kemudian digunakan pada rpa. optimasi rpa dilakukan pada suhu39°c dengan variasi waktu inkubasi 30, 40, dan 50 menit. hasil amplifikasidianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa. hasil: dna hasil ekstraksimemiliki konsentrasi 21,50 ng/µl dan rasio 1,845. dari tiga pasangan primer,primer dengan target amplikon 499 bp menunjukkan amplifikasi paling spesifik.rpa berhasil mendeteksi hpv-16 secara konsisten dengan kondisi optimal padasuhu 39°c selama 30 menit. penambahan waktu inkubasi tidak memberikanpeningkatan intensitas pita. kesimpulan: teknik rpa efektif untuk mendeteksihpv-16 pada lini sel scc dengan kondisi optimal tersebut dan berpotensi menjadimetode deteksi yang lebih cepat dan praktis dibandingkan pcr.